ԴՆԹ կոմետի մեթոդ

ԴՆԹ կոմետի մեթոդ, ԴՆԹ-ի վնասը գրանցելու և մեկ բջջի մակարդակում վերականգնումն ուսումնասիրելու մեթոդ։ Մեթոդն ի վիճակի է հայտնաբերել ԴՆԹ-ի շղթայի ճեղքերը առանձին բջիջներում։ Համարվում է արագ և շատ զգայուն։

Պատմություն

Առանձին բջիջներում ԴՆԹ-ի վնասների ուսումնասիրման գործում Ռիդբերգի և Յոհանսոնի աշխատանքը համարվում է առաջին հաջողված փորձը (1978թ.): Հետագայում մեթոդը բազմիցս փոփոխվել և կատարելագործվել է՝ այն պարզեցնելու և բջջային ԴՆԹ-ի վնասը հայտնաբերելու զգայունությունը բարձրացնելու նպատակով։

Կիրառելիություն

ԴՆԹ կոմետի մեթոդը կիրառելի է in vivo և in vitro համակարգերում։ Ներկայումս մեթոդը լայնորեն օգտագործվում է իոնացնող ճառագայթման գենոտոքսիկության, դեղագործական և արդյունաբերական քիմիական նյութերի, ԴՆԹ-ի վերականգնման, ապոպտոզի, նախածննդյան ախտորոշման, քաղցկեղի հակվածության, քաղցկեղի բուժման և կատարակտի կլինիկական հետազոտություններում։ Այս մեթոդը աստիճանաբար դառնում է բիոմոնիտորինգի ծրագրերի անբաժանելի մասը.

• ԴՆԹ-ի վնասների կուտակման և վերականգման վրա սննդակարգի, շրջակա միջավայրի գործոնների, նյութափոխանակության և ֆիզիոլոգիական վիճակի փոփոխությունների, մարմնի ծերացման ազդեցության գնահատում,
• ռադիոպաշտպանիչ ազդեցության մեխանիզմների, ռադիոադապտիվ արձագանքի ձևավորման գնահատում,
• Էկոլոգիական ուսումնասիրությունների կատարում,

Մեթոդի օգտագործումը հնարավորություն է տալիս հաշվի առնել բարդ պոպուլյացիաների տարասեռությունը և ուսումնասիրել ԴՆԹ-ի վնասման և վերականգնման արդյունքը գրեթե ցանկացած էուկարիոտ բջիջներում։ Այս դեպքում փորձանմուշի միայն մի քանի հազար բջիջ է պահանջվում վերլուծության համար։

Մեթոդի կառավարում

Ուսումնասիրվող գործոնի ազդեցության տակ գտնվող բջիջների անշարժացումն իրականացվում է ցածր հալեցման ագարոզայի մեջ, որը մանրադիտակի համար քսվում է ծածկապակու վրա։ Աղի բարձր պարունակությամբ բուֆերում նմուշների մշակումը հանգեցնում է բջջային թաղանթների լիզիսի և սպիտակուցների դենատուրացիայի։ ԴՆԹ-ի մոլեկուլները բաժանվում են էլեկտրոֆորեզի միջոցով, ԴՆԹ-ի հետքերը պատկերացվում են ֆլուորեսցենտ ներկով ներկելու միջոցով, և նմուշներն այնուհետև հետազոտվում են մանրադիտակով։ ԴՆԹ-ի վնասվածքների առկայության դեպքում քրոմատինի կառուցվածքային ամբողջությունը խաթարվում է, և ԴՆԹ-ի վերասպիրալավորումը կորչում է, ինչը հանգեցնում է այս կենսամակրոմոլեկուլի թուլացմանը, և ձևավորվում են ԴՆԹ-ի բեկորներ, որոնք կապված չեն բջջի հետ։ Էլեկտրական դաշտում թուլացած օղակները և ԴՆԹ-ի բեկորները ձգվում են դեպի անոդ, ինչը դիտվող առարկաներին տալիս է «գիսաստղերի» տեսք (այստեղից էլ սովորաբար օգտագործվում է «comet assay» անվանումը)։ ԴՆԹ-ի քանակը, որը գաղթել է դեպի անոդ և որոշվում է միկրոֆոտոմետրով, կարող է օգտագործվել որպես հետազոտվող բջիջներում ԴՆԹ-ի վնասման մակարդակը բնութագրող ցուցանիշ։ «Կոմետները» վերլուծվում են կամ տեսողական դիտարկմամբ և «կոմետների» տարբերակմամբ՝ ըստ ԴՆԹ-ի վնասվածության աստիճանի, կամ համակարգչային պատկերների մշակման ծրագրերի միջոցով։ վերլուծության վերջին մեթոդը հատկապես անհրաժեշտ է վնասող նյութի փոքր կոնցենտրացիայի ազդեցության օբյեկտիվ գնահատման կամ բջիջների ենթապոպուլյացիաների միջև նուրբ տարբերությունները պարզելու համար։

Մեթոդի հաստատում

Ներկայումս հետազոտության մեջ այս մեթոդաբանական մոտեցումն իրականացրած լաբորատորիաների մեծ մասը մշակել են արձանագրության բազմաթիվ տարբերակներ, մասնավորապես բջիջների լիզիսի, դենատուրացիայի, էլեկտրոֆորեզի և ԴՆԹ-ի ներկման տևողությունը և պայմանները։ Մեկ ծածկապակու վրա կրկնօրինակով հաշվվում է 25-500 բջիջ։ Փորձի արդյունքները համարվում են հավաստի, երբ կրկնվում են առնվազն 6 անգամ։ ԴՆԹ կոմետի վերլուծությունը կարող է իրականացվել տեսողական կամ ապարատային և ծրագրային համալիրի միջոցով։ Տեսողական վերլուծության ժամանակ ԴՆԹ-ի կոմետները դասակարգվում են հինգ պայմանական տիպերի՝ 0-ից 4-ի համապատասխան թվային արժեքով։

Ինդեքսների հաշվարկ

Նշանակում	Բնութագրություն	Հաշվարկ
${\mathsf {\mbox{I}}}_{\mbox{dc}}$	ԴՆԹ կոմետի ինդեքս (index of DNA comet) ${\mathsf {\mbox{I}}}_{\mbox{dc}}$ — ԴՆԹ-ի վնասվածության աստիճան ԴՆԹ կոմետի ինդեքս — հաշվարկվում է որպես յուրաքանչյուր տեսակի «ԴՆԹ-կոմետների» գումարի հարաբերությունը հաշվված «ԴՆԹ կոմետների» ընդհանուր քանակին։	${\mathsf {\mbox{I}}}_{\mbox{dc}}={\frac {(0{\mbox{n}}_{0}+1{\mbox{n}}_{1}+2{\mbox{n}}_{2}+3{\mbox{n}}_{3}+4{\mbox{n}}_{4})}{\Sigma }}$ , որտեղ ${{\mbox{n}}_{0}-{\mbox{n}}_{4}}$ — «ԴՆԹ կոմետների» յուրաքանչյուր տեսակի թիվն է, իսկ ${\Sigma }$ — «ԴՆԹ կոմետների» հաշվարկված գումարը

Պատկերների և վերլուծությունների հետ աշխատելու ծրագրեր

• CometScore — անվճար ծրագիր ԴՆԹ կոմետի ցուցիչների կիսաավտոմատ հաշվարկների համար՝ համատեղելի է Windows 5-ի և 6-ի հետ։
• CaspLab — GPL software.
• Կոմերցիոն ծրագիր Արխիվացված 2023-11-19 Wayback Machine — listed by Comet Assay Interest Group

Գրականություն

• Բնապահպանական անբարենպաստ գործոնների երկարատև ազդեցությունը ուղեկցվում է ԴՆԹ-ի վնասների կուտակումով և վերականգնող համակարգի գործունեության փոփոխություններով, ինչը կարող է հանգեցնել մուտացիաների և բջջի չարորակ վերափոխման։ Վերջին տարիներին բազմաթիվ մեթոդներ են մշակվել ԴՆԹ-ի վնասը գրանցելու և նաև վերականգնման գործընթացները ուսումնասիրելու համար։ Այնուամենայնիվ, դրանցից ոչ բոլորն ունեն բավարար զգայունություն և յուրահատկություն՝ վերահսկելու շրջակա միջավայրի գործոնների հետևանքով առաջացած ԴՆԹ-ի վնասների լայն շրջանակը։ Վերանայման նպատակն է գնահատել լուծված միայնակ բջիջների գելային էլեկտրոֆորեզի մեթոդի արդյունավետությունը (ԴՆԹ կոմետի մեթոդ)՝ շրջակա միջավայրի տարբեր գործոններից առաջացած ԴՆԹ-ի վնասը հայտնաբերելու համար։ Մեթոդն ունի զգայունություն, որն անհրաժեշտ է ԴՆԹ-ի վնասը հայտնաբերելու և առանձին բջջի մակարդակում վերականգնելու համար և կարող է օգտագործվել գենոմի ամբողջականությունը գնահատելու համար։
• ՈՒ.Բ. Սորոչինսկ, Վ.Մ. Միխալեյնկ ԴՆԹ կոմետի մեթոդի կիրառում շրջակա միջավայրի տարբեր գործոններից առաջացած ԴՆԹ-ի վնասը գնահատելու համար(ռուս.) // ՕՆԿՈԼՈԳԻԱ : Հոդված. — Կիև, 2008. — В. 3. — Т. 10. — С. 303—309. Архивировано из первоисточника 5 Մարտի 2016.
• Avishai, Nanthawan; Rabinowitz, Claudette; Moiseeva, Elisabeth & Rinkevich, Baruch Genotoxicity of the Kishon River: the application of an in vitro cellular assay : HTML abstract. — Israel: Mutation Research, 2002. — В. 518. — Т. 1. — С. 21–37. —
• Collins, A.R.; Dobson, V.L.; Dusinska, M.; Kennedy, G. & Stetina, R. The comet assay: what can it really tell us? // Mutation Research : HTML abstract. — 1997. — В. 375. — Т. 2. — С. 183—193. —
• Klaude, M.; Eriksson, S.; Nygren, J. & Ahnstrom, G. The comet assay: mechanisms and technical considerations. — Mutation Research, 1996. — В. 363. — Т. 2. — С. 89—96. —
• McKelvey-Martin, Valerie J.; Ho, Edwin T.; McKeown, Stephanie R.; Johnston, S. Robin; McCarthy, Patsy J.; Rajab, Nor Fasilah & Downes, C. Stephen Emerging applications of the single cell gel electrophoresis (Comet) assay. I. Management of invasive transitional cell human bladder carcinoma. II. Fluorescent in situ hybridization Comets for the identification of damaged and repaired DNA sequences in individual cells : PDF fulltext. — Mutagenesis, 1993. — В. 13. — Т. 1. — С. 1—8. —
• Olive, P.L.; Wlodek, D. & Banath, J.P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis // Cancer Research : PDF fulltext. — 1991. — В. 51. — Т. 17. — С. 4671—4676.
• Rojas, E.; Lopez, M.C. & Valverde, M. Single cell gel electrophoresis: methodology and applications // Journal of Chromatography B : HTML abstract. — 1999. — Т. 722(1-2). — С. 225—254. —
• Singh, N.P.; McCoy, M.T.; Tice, R.R. & Schneider, E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Experimental Cell Research. — 1988. — Т. 175(1). — С. 184—191. —