Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա

Վիքիպեդիայից՝ ազատ հանրագիտարանից

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (ՊՇՌ) նուրբ մեթոդ է, որը կրկնահանում է (ամպլիֆիկացնում է) ԴՆԹ-ն և թույլ է տալիս հայտնաբերել մեկ որոշակի առանձնահատուկ ԴՆԹ-ի մոլեկուլ միլիոնավոր ուրիշ մոլեկուլների առկայության դեպքում։ Մեթոդի էությունը կայանում է բազմակի ամպլիֆիկացիայի մեջ, որը իրականացվում է ԴՆԹ-ի որոշակի տեղմասերում փորձանոթների մեջ կրկնվող ջերմային ցիկլերի (բոլորապտւյտների) ընթացքում։ Ամպլիֆիկացիայի յուրաքանչյուր ցիկլում վաղաժամ սինթեզված հատվածները նորից կրկնահանվում են։ Դրա շնորհիվ տեղի է ունենում ԴՆԹ-ի առանձնահատուկ հատվածների քանակի բազմակի ավելացում միլիարդավոր անգամ։ ՊՇՌ մեթոդը հնարավորություն է տալիս արագ և նյութական ռեսուրսների և ժամանակի ոչ մեծ ծախսերով, ստանալ ավելի քան 10.000.000 որոշակի հաջորդականությամբ ԴՆԹ-ի կրկնօրինակներ, նախապես առաջարկված մեկ կամ մի քանի մոլեկուլներով:

Պատմություն[խմբագրել]

Վերջին տասնամյակում մոլեկուլային կենսաբանության բնագավառում ՊՇՌ-ի մեթոդի հայտնագործումը դարձել է առավել նշանավոր իրադարձություններից մեկը։ 1983թ Քերրի Մյուլիսը հայտնաբերեց ԴՆԹ-ի որոշակի տեղամասերի in vitro ամպլիֆիկացիայի մեթոդը պոլիմերազային ռեակցիայի կրկնվող ջերմային ցիկլերի ընթացքում։ 1985թ այս մեթոդը առաջին անգամ օգտագործվեց գործնականում բետա-գլոբինի գենի տեղամասի ամպլիֆիկացիայի համար ԴՆԹ- պոլիմերազի մեծ հատվածի օգնությամբ (Կլենովի հատված)։ ՊՇՌ-ի լայն տարածումը սկսվեց 1988թ համահեղինակ Սայքի հիմնական աշխատանքի հրատարակության պահից, որտեղ հեղինակները օգտագործել են թերմոֆիլաների ԴՆԹ-պոլիմերազներ և դիտարկել են մեթոդի տեսական հիմքերը, այս հոտդածը 1988-89թթ դարձավ առավել մեջ բերվող, իսկ 1993թ Քերրի Մյուլիսին շնորհվեց նոբելյան մրցանակ ՊՇՌ մեթոդի հայտնագործման համար։ ՊՇՌ-ի կազմակերպման համար խառնուրդի մեջ մտնող բաղադրիչների կազմը և պրայմերների (ԴՆԹ-ի կարճ արհեստական սինթեզված մոլեկուլ) օգտագործման հիմնական սկզբունքները ԴՆԹ-ի կրկնօրինակը ստանալու համար առաջին անգամ նկարագրվել 1971 թ-ին Քլեփի կողմից։ Սակայն, այն ժամանակ դեռևս դրսևորված չէր ՊՇՌ-ի հիմնական հատկանիշը` ԴՆԹ-ի սկզբնական հատվածի կրկնօրինակման քանակի աստիճանական ավելացումը, որպես արդյունք։ 1983 թ-ին ՙCetus՚ ձեռնարկության աշխատակից Կերի Մյուլիսը առաջարկեց մի մեթոդ, որը հետագայում հայտնի դարձավ որպես պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա` ՊՇռ։ Արժե նշել, որ այս հայտնագործմանը համընթաց ուղեկցում էր որոշ տեխնոլոգիաների զարգացումը։ Մասնավորապես այն սարքերի ի հայտ գալը, որոնք թույլ էին տալիս ավտոմատ սինթեզել ԴՆԹ-ի միաշղթա հատվածները (օլիգոնուկլեոտիդները)։ Միևնույն ժամանակ հայտնաբերվեցին գեյզերներում ապրող եզակի միկրոօրգանիզմներ, որոնց ֆերմենտային համակարգը, մասնավորապես ԴնԹ-պոլիմերազը, բարձր ջերմաստիճաններում պահպանում է իր կենսաբանական ակտիվությունը ընդհուպ մինչև 95˚C, որը համարվում է անհրաժեշտ պայման պոլիմերացման շղթայական ռեակցիա անցկացնելու համար։ ՊՇՌ-ի հայտնագործման արդյունքը դարձավ մեթոդի գրեթե անհապաղ գործնական կիրառումը։ Այդ պահից հրատարակությունների քանակը, որոնցում հեղինակները հայտնում էին իրեց աշխատանքներում պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի կիրառման մասին, սկսեց աճել երկրաչափական պրոգրեսիայով: Այս մեթոդը այնքան հանրամատչելի դարձավ, որ մոլեկուլյար կենսաբանության ոլորտում այսօր արդեն դժվար է պատկերացնել աշխատանք առանց դրա օգտագործման։ ՊՇՌ-ի մեթոդի բուռն զարգացումը ստացվել է հատկապես շնորհիվ ՙմարդու գենոմ՚ միջազգային ծրագրի։ Ստեղծվեցին ժամանակակից լազերային տեխնոլոգիաներ, որոնք վերծանում են ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդների հաջորդականությունը։ Եթե ոչ վաղ անցյալում 250 զույգ նուկլեոտիդների ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդների վերծանման համար պահանջվում էր մեկ շաբաթ, ապա ժամանակակից լազերային սեկվենատորները թույլ են տալիս մեկ օրում որոշել մինձև 5000 զույգ նուկլեոտիդներ։ Սա իր հերթին նպաստում է ԴՆԹ-ի հաջորդականության մասին ինֆորմացիայի տվյալների բազայի նշանակալից աճին։ Ներկայումս մշակվել են պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի բազմազան մոդիֆիկացիաներ (վերափոխումներ), ցույց է տրված թեստ-համակարգի ստեղծման հնարավորությունը միկրօրգանիզմների, բույսերի տարբեր հիվանդությունների և դրանց նկատմամբ կայունության գեների, կետային մուտացիաների հայտնաբերման համար, նկարագրված են մեթոդի տասնյակ տարբեր կիրառություններ։

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի սկզբունքները[խմբագրել]

ՊՇՌ-ն ԴնԹ-ի ամպլիֆիկացիայի մեթոդ է, որի միջոցով մի քանի ժամվա ընթացքում, միլիարդավոր անգամ կարելի է բազմապատկել (անջատել և շատացնել) ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականություն։ Ունեցած ԴՆԹ-ի օրինակի հետազոտումը, զգալիորեն հստակեցնում է հսկայական քանակի կրկնօրինակ ստանալու հնարավորությունը, խիստ որոշակի գենոմի տեղամասից։

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի բաղադրիչներ[խմբագրել]

ՊՇՌ անցկացնելու համար ռեակցիոն խառնուրդում պետք է առկա լինեն հետևյալ բաղադրիչները`

Պրայմերներ - արհեստական սինթեզված օլիգոնուկլեոտիդներ, որպես կանոն 15-ից մինչև 30 զույգ նուկլեոտիդներ, նույնությամբ համապատասխանելի տեղամասի ԴՆԹ-ի նշանին։ Նրանք կարևոր դեր են խաղում ամպլիֆիկացիայի իրականացման համար։ Ճիշտ ընտրված պայմանները ապահովում են թեստ-համակարգի յուրահատկությունն ու զգայունությունը։

Taq-պոլիմերազ - ջերմակայուն ֆերմենտ է, որը հնարավոր է դարձնում իրականացնել ԴՆԹ-ի –րդ շղթայի 3` ծայրի կառուցումը կոմպլեմենտարության սկզբունքի համաձայն : Դեզօքսինուկլեոտիդտրիֆոսֆատների խառնուրդ (դնՏՖ) - դեզօքսիադենոզինտրիֆոսֆատ (դԱՏՖ), դեզօքսիգուանոզինտրիֆոսֆատ (դԳՏՖ), դեզօքսիցինտրիֆոսֆատ (դՑՏՖ) և դեզօքսիտիմիդինտրֆոսֆատ (դՏՏՖ) -ՙշինարարական նյութ՚:

Բուֆֆերկատիոնների և անիոնների որոշակի խտությամբ խառնուրդ։ Ապահովվում են փոխազդման համար լավագույն պայմանները, ինչպես նաև pH-ի կայուն արժեք։

Ուսումնասիրվող նմուշ – ԴՆԹ-ի մոլեկուլ է, որն ավելացվում է փոխազդող խառնուրդի մեջ, այն կարող է իր մեջ ամփոփել պահանջվող (որոնելի) ԴՆԹ-ի հատվածը։

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի փուլերը[խմբագրել]

Եթե ուսումնասիրվող նմուշում առկա է պահանջվող ԴՆԹ-ն, ապա ամպլիֆիկացիայի պրոցեսում դրա հետ կատարվում են մի շարք փոփոխություններ, որոնք ապահովվում են որոշակի ջերմային ցիկլերով: Ամպլիֆիկացիայի յուրաքանչյուր ցիկլ բաղկացած է 3 էտապից։

Բնափոխում (դենատուրացիա):[խմբագրել]

Առաջին էտապում անհրաժեշտ է բնափոխել նմուշային ԴՆԹ-ն։ Դրա համար փոխազդող խառնուրդը տաքացնում են մինչև 92-95˚C , որի արդյունքում ԴՆԹ-ի երկշղթայական մոլեկուլները բացվում են դառնալով երկու միաշղթայական մոլեկուլ։

Շիկամշակում:[խմբագրել]

2-րդ էտապում պրայմերները միանում են միաշղթա ԴՆԹ-ի նշանին։ Այս պրոցեսը կրում է ՙշիկամշակում՚ անվանումը, որը ծագում է անգլերեն ՙannealing՚ մետաղագործական տերմինից, որը նշանակում է որոշակի ռեժիմում ձուլվացքի սառեցումը։ Պրայմերները ընտրում են այնպես, որ նրանք սահմանափակում են պահանջվող հատվածը և կոմպլեմենտարորեն հակադիր են ԴՆԹ-ի շղթաներին։ Շիկամշակում տեղի է ունենում Չարգաֆֆի կոմպլեմենտարության կանոնին համապատասխան, այսինքն` ԴՆԹ-ի երկշղթանի մոլեկուլում ադենինի դիմաց միշտ գտնվում է թիմինը, իսկ գուանինի դիմաց ` ցիտոզինը:Եթե այս սկզբունքը չի պահպանվում, ապա պրայմերների շիկամշակում տեղի չի ունենում: Պրայմերների շիկամշակումից հետո Taq – պոլիմերազը, սկսելով պրայմերի 3` ծայրից, կառուցում է ԴՆԹ-ի 2-րդ շղթան։

Էլոնգացիա (սինթեզ):[խմբագրել]

3–րդ էտապում փոխազդող խառնուրդում ջերմաստիճանը հասցվում է մինչև Taq – պոլիմերազի աշխատանքի օպտիմումը, հնարավոր է դառնում օգտագործել պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի երկփուլանի ցիկլը, համատեղելով երկու փուլերը` շիկամշակումը և էլոնգացիան մեկի մեջ։ Հետագա փուլում շիկամշակումն ու էլոնգացիան բազմիցս կրկնվում են ( ավելի քան 30 անգամ)։ Յուրաքանչյուր ցիկլում ԴՆԹ-ի հատվածի սինթեզված կրկնօրինակի քանակը կրկնապատկվում է :

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի ցիկլային սինթեզի արդյունքը[խմբագրել]

ԴՆԹ-ի առանձին հատվածի քանակի աստիճանական մեծացում կարելի է արտահայտել հետևյալ բանաձևով`

A=M*(2n-n-1)~2n

որտեղ ` A-ամպլիֆիկացիայի համար պրայմերների քանակն է ,

M -ԴՆԹ-ի սկզբնական քանակը,
n - ամպլիֆիկացիայի ցիկլերի թիվը:

Փաստորեն, որոշ տվյալների հիման վրա, ամպլիֆիկացիայի առանձին ցիկլերի արդյունավետության աստիճանը կազմում է 78-97%: Այս արժեքը կարող է ավելի քիչ լինել այն դեպում, երբ փոխազդման խառնուրդում առկա լինեն ինհիբիտորներ: Այդ պատճառով, ամպլիֆիկացիայի արտադրանքի իրական քանակը ավելի լավ կնկարագրի հետևյալ հավասարումը`

A=M*(1+E)n

որտեղ ` E - փոխազդման արդյունավետության արժեքն է: Արժե նկատել, որ ամպլիֆիկացիայի ընթացքում նախնական շղթայի վրա սինթեզվում են նաև երկարավուն հատվածներ, այնուամենայնիվ, դրանց կուտակումը տեղի է ունենում միայն թվաբանական պրոգրեսիայով հետևյալ բանաձևով `

K = M*n

որտեղ` K - ամպլիֆիկացիայի երկարավուն արտադրանքի քանակն է ,

n – ցիկլերի թիվը։

Այսպիսով, առանձին հատվածները սահմանափակված պայմաններում առաջինն են հայտնվում 2-րդ ցիկլի վերջում, կուտակվում են երկրաչափական պրոգրեսիայով և շատ շուտով սկսում եմ գերակշռել ամպլիֆիկացիայի արտադրնքների թվում։

Պլատոյի` ՙԲարձրահարթի էֆեկտը՚[խմբագրել]

Նկատի առնենք, որ ամպլիֆիկացիայի պրոդուկտների կուտակման ընթացքը երկրաչափական պրոգրեսիայով ընթանում է միայն սահմանափակ ժամկետում, իսկ հետո դրա արդյունավետությունը բեկումնային ընկնում է։ Սա կապված է այսպես կոչված ՙբարձրահարթի՚ էֆեկտով։ Այս տերմինն օգտագործում են ամպլիֆիկացիայի վերջին ցիկլերում ՊՇՌ-ի պրոդուկտների կուտակման ընթացքը նկարագրելու համար, երբ ամպլիկոնների քանակը հասնում է 0,3-1 մոլի: Կախված պայմաններից և ամպլիֆիկացիայի փոխազդման ցիկլերի քանակից, ՙբարձրահարթի՚ էֆեկտին հասնելու պահին ազդում են սուբստրատների (դնՏՖ-ի և պրայմերների) ուտիլիզացիան (օգտագործումը), ռեակտանտների կայունությունը (դնՏՖ-ի և ֆերմենտի), ինհիբիտորների քանակը ներառյալ պիրոֆոսֆատները և ԴՆԹ-դուպլեքսները, մրցակցությունը ոչ յուրահատուկ արտադրանքների ռեակտատների կամ պրայմեր-դիմերմերի համար, առանձնահատուկ արտադրանքի խտությունը և ոչ ամբողջական բնափոխումը ազդում են ամպլիֆիկացիայի արտադրանքների բարձր խտություն աստիճանի դեպքում։ Որքան փոքր է հետազոտվող ԴՆԹ-ի սկզբնական խտությունը, այնքան բարձր է փոխազդման ելքի ռիսկը դեպի ՙբարձրահարթի՚ էֆեկտը։ Այս պահը կարող է վրա հասնել մինչև այն, երբ ամպլիֆիկացիայի առանձնահատուկ արտադրանքի քանակը բավարար կլինի, որպեսզի հնարավոր դառնա վերլուծման ենթարկել դրանց։ Միայն լավագույն թեստ-համակարգերն են թույլ տալիս խուսափել դրանից։

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի կազմակերպման փուլերը[խմբագրել]

Կենսաբանական նյութի փորձարկման նախապատրաստությունը Կախված առաջադրված խնդրից ԴՆԹ-ի անջատման համար օգտագործում են տարբեր մեթոդիկաներ։ Դրանց էությունն է նմուշից ԴՆԹ-ի լուծազատումը (ստացումը) և հեռացումը կամ չեզոքացումը կողմնակի խառնուրդներից ԴՆԹ-ի մաքուր պատրաստուկ ստանալու համար, որը պիտանի է ՊՇՌ կազմակերպելու համար։ Երբեմն բավական է լինում 5-10 րոպե լավ եռացնել, սակայն, մեծամասամբ պահանջվում է ավելի բարդ մեթոդներ։ ԴՆԹ-ի մաքուր պատրաստուկի ստացման ստանդարտ և արդեն դասական դարձած մեթոդը նկարագրվում է Դոյլի կողմից։ Այն իրենից ներկայացնում է ԴՆԹ-ի անջատման CTAB մեթոդը։ Դոյլի մեթոդը փոքր մոդիֆիկացիաներով կիրառվել է մեր կողմից։

Ամպլիֆիկացիա և պրոդուկտների հայտնաբերում Ամլիֆիկացիա իրականացնելու համար անհրաժեշտ է նախապատրաստել փոխազդող խառնուրդ և նրա մեջ ներառել ԴՆԹ-ի վերլուծվող նմուշը։ Ընդ որում, կարևոր է հաշվի առնել պայմանների շիկամշակման որոշ առանձնահատկություններ։ Բանն այն է, որ որպես կանոն, վերլուծվող կենսաբանական նմուշում մասնակցում են (առկա) են ԴՆԹ-ի տարբեր մոլեկուլներ, որոնց նկատմամբ ռեակցիայում օգտագործվող պայմանները ունեն մասնակի, իսկ որոշ դեպքերում զգալի համաբանություն (հոմոլոգիա)։ Բացի դրանից, պրայմերները կարող են միմյանց հետ թրծվել առաջացնելով պրայմերներ-դիմերներ։ Թե մեկը, թե մյուսը հանգեցնում են պրայմերների զգալի սպառման ռեակցիայի նյութերի երկրորդական (ոչ հատուկ) սինթեզի վրա, և որպես հետևանք, զգալիորեն պակասեցնում են համակարգի զգայունությունը: Դա դժվարեցնում կամ անհնարին է դարձնում էլեկտրոֆորեզով իրականացված ռեակցիայի արդյունքների ընթերցումը։ Միջոցները, որոնք թույլ են տալիս զգալի չափով իրականացնել պրայմերների ոչ հատուկ շիկամշակումը։

Գրականություն[խմբագրել]

  • Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols. 226. pp. 3–6. doi:10.1385/1-59259-384-4:3. ISBN 1-59259-384-4. edit
  • Bing, D. H., C. Boles, F. N. Rehman, M. Audeh, M. Belmarsh, B. Kelley, and C. P. Adams. (1996). "Bridge amplification: a solid phase PCR system for the amplification and detection of allelic differences in single copy genes". Genetic Identity Conference Proceedings, Seventh International Symposium on Human Identification.
  • Cheghamirza K., Koveza O., Konovalov F. and Gostimsky S. ( 2002). “Identification of RAPD markers and their use for molecular mapping in pea (Pisum sativum L.)”. Cell. Mol. Biol. Lett. 7(2B)։ 649-655. pp.
  • "Chemical Synthesis, Sequencing, and Amplification of DNA (class notes on MBB/BIO 343)". Arizona State University. Retrieved 2007-10-29.
  • Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin и W.M. Gelbart. (1996). An introduction to genetic analysis (6th edn.).
  • Kleppe, K. et al. (1971). "Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases". J. Mol. Biol. 56 (2): 341–361.
  • Stpeien L. J. et al. Appl. (2001).Genet. 40: 317-334. pp.
  • Venter J, et al. (2001). «The sequence of the human genome». Science 291 (5507)։ 1304-51. PMID 11181995

Արտաքին հղումներ[խմբագրել]